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免疫酶标

1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)用于IgG定量测定的文章,使得1966年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性与酶的高效催化作用有机结合的一种方法。

它以酶作为标记物,与抗体或抗原联结,与相应的抗原或抗体作用后,通过底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量,亦可用于组织中抗原或抗体的定位研究,即酶免疫组织化学技术。

目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验(ELISA),它是使抗原或抗体吸附于固相载体,使随后进行的抗原抗体反应均在载体表面进行,从而简化了分离步骤,提高了灵敏度,即可检测抗原,也可检测抗体。

(1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);

(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);

(3)酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不同类型的检测方法。

(1)双抗体夹心法

为了检测抗原可用夹心法。将特异性抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯制成的小管、小盘或小孔)上,然后加被测溶液,倘样品中有相应抗原,则与抗体在载体表面形成复合物。洗涤后加入酶标记的特异性抗体,后者通过抗原也结合到载体的表面。洗去过剩的标记抗体,加入酶的底物,在一定时间内经酶催化产生的有色产物的量与溶液中抗原含量成正比,可用肉眼观察或分光光度计测定。

(2)双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时,如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体,则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作,缩短了反应时间,如应用高亲和力的单克隆抗体,测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

(3)间接法测抗体

为了检测抗体可用间接法。使抗原吸附于载体上,然后加入被测血清,如有抗体,则与抗原在载体上形成复合物。洗涤后加酶标记的抗球蛋白(抗抗体)与之反应。洗涤后加底物显色,有色产物的量与抗体的量成正比。

(4)竞争法

竞争法可用于测定抗原,也可用于测定抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。

(5)捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法,先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上,在去除IgG后再测定特异性IgM。

常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),相应的底物分别是邻苯二胺(OPD)和对硝基苯磷酸盐,前者呈色反应为棕黄色,后者为蓝色。可用目测定性,也可用酶标仪测定光密度(OD)值以反映抗原含量。

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